11双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶

发布于:2021-09-22 19:52:17

第 37 卷 第 5 期 化      学 工 程 Vol 37 No. 5 .                            2009 年 5 月 CHE ICAL ENGI EER I G (CH I A ) M N N N M ay 2009

双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶
杨建军 , 马晓迅
(西北大学 化工学院 , 陕西 西安  710069)

摘要 : 对南极假丝酵母脂肪酶 ( CAL )在双水相中的分配情况进行了研究 ,考察了温度 、 聚乙二醇 ( PEG) 相对分子质 量、 NaCl质量分数和 (NH4 ) 2 SO4 质量分数对分配系数 K ( CAL ) 的影响 , 结果表明 : 温度对 K ( CAL ) 影响不大 ; 低相 对分子质量 PEG 与蛋白质的疏水作用可促进 CAL 的分配 ; 二相间电势差等对分配*衡 、 有较大影响 。在 PEG
2 000 / (NH4 ) 2 SO4双水相体系中 , CAL 最佳的萃取分离条件为 : 室温下 , 质量分数 20% PEG2 000, 12% ( NH4 ) 2 SO4 , 1. 5%NaCl,此时 , K (CAL )为 8. 16, CAL 回收率为 91. 2% 。

关键词 : 脂肪酶 ; 双水相 ; 分离纯化 中图分类号 : Q 814. 1     文献标识码 : A     文章编号 : 1005 2 9954 (2009) 05 2 0049 2 04

( School of Chem ical Engineering, Northwest University, Xi′ 710069, Shaanxi Province, China ) an

已成为*年来新能源研究的热点之一 。为了消除 杂质的负面影响 , 提高固定化脂肪酶的催化效率 , 本文通过研究聚乙二醇 ( PEG ) /硫铵双水相系统
( A TPS) 中脂肪酶的分离行为 , 介质条件变化对分

离过程的影响 , 为生物柴油生产用脂肪酶的纯化 提供技术条件 。
1  材料与方法 1. 1   材料

天津科密欧。

Abstract: The partition behavior of Cand ida an ta rctica lipase ( CAL ) in aqueous two 2 phase system ( ATPS ) was investigated. The effects of temperature, relative molecular mass of polyethylene glycol ( PEG) , the mass fraction of NaCl and (NH4 ) 2 SO4 on partition coefficient of CAL K ( CAL ) were studied. The results show that in ATPS, temperature was uni portant for partition coefficient of CAL K ( CAL ) , while the electric potential difference m betw een top and bottom phase was i portant It was also discovered that the less the molecule m ass of PEG was, m . the more favorable conditions for the CAL congregation into the phase because of the increased hydrophobicity for ed. A t the room temperature, the op ti ized extraction conditions were as follow s: m ass fraction 20% PEG m m Key words: lipase; ATPS; purification 2 000, 12% (NH4 ) 2 SO4 , 1. 5%NaCl, and K ( CAL ) was 8. 16, the recovery rate of CAL was 91. 2%.

   固定化脂肪酶催化酯交换反应生产生物柴油

考 马 斯 亮 兰 250, PEG1 000, PEG2 000, PEG

10 000,牛血清蛋白 , 国药集团 ; PEG4 000, PEG6 000,

作者简介 : 杨建军 ( 1973 —) ,男 ,工程师 ,博士生 ,研究方向为生物催化与生物质转化 , E 2 mail: mysyjj@163. com; 马晓迅 ( 1957 —) , 男 , 教授 , 博士生导师 ,通讯联系人 ,电话 : ( 029) 88302633, E 2 mail: maxym @ nwu. edu. cn。

Separa tion and pur if ica tion of Candida an ta rctica lipa se in aqueous two2pha se system
YANG J ian 2jun, M A X i o 2xun a 1. 2   方法 1. 2. 1   蛋白质质量分数测定

每一相中总的蛋白质质量分数在吸光度 595 nm 。

处采用 B radford法测定 , 以牛血清白蛋白为标准蛋 白
[1]

1. 2. 2   脂肪酶活力测定 1. 2. 3   双水相体系制备

量分数较 PEG/磷酸盐体系低 ,又由于硫铵的水化能较 低 ,相同相对分子质量的 PEG成相所需硫铵的质量分 数也较低
[2]

脂肪酶活力测定按照 QB / T1803 2 1993 标准 。 。故选 PEG/硫铵体系作为研究对象。

在 PEG/硫铵双水相体系中 ,成相所需的 PEG质

按照实验选定的条件 ,将质量分数 50%的 PEG溶

?50?

化学工程  2009 年第 37 卷第 5 期

液与 40%的硫铵溶液配成相应的双水相体系 ,再加入 已经配好的脂肪酶溶液至 10 g。在旋涡混合器上混合 5 m in,室温下静置 2 h,用移液器分别转移上相和下相 于离心管中离心 ,离心机转速为 2 000 r/m in。用微量 注射器吸取一定量的上相和下相 ,测定其中的脂肪酶 活性及其质量分数 ,计算分配系数和回收率。 1. 2. 4   分配系数的确定 ( 1 )分配系数 K ( 1) K =ρ / b t ρ ρ 和 ρ 分别为上相和下相中被分离蛋白质的 式中 : t b *衡质量浓度 。 ( 2 ) 酶回收率 yt ( % ) ( 2) yt = R K / ( 1 + R K ) 式中 :相比 R = V t /V b , V t 和 V b 是上下相体积 。
( 3 ) 热动力学方程的确定
[3 ]

焓变 (ΔH ) 与蛋白质在 ATPS 中的分配有关 , 可以通过 Van ′Hoff公式计算 , 由 2 个不同温度 T1 , t T2 下的分配系数 K1 , K2 得到 ΔH 自由能变 熵变
= R ln
K1

1

K2 T1

-

1
T2

( 3) ( 4) ( 5)

ΔG = - R T ln K ΔS = (ΔG - ΔH ) / T

2  结果与讨论 2. 1   温度对 CAL 分配的影响

在 20, 30, 40 ℃, 分别对 CAL 在二相中的分配情 况进行研究 , 并根据有关的热力学方程对其 ΔG , ΔH 和 ΔS 进行计算。结果如图 1,ΔH 2 S 对点变 Δ 化的线性关系与蛋白质疏水区周围水的有序损失有 联系 ( PEG的乙烯链和蛋白质的表面疏水区域一起暴 露在溶剂中 ) , 表明在此过程中水起到了重要作用
[4 ]



Fig 1  Entrop ic2enthalp ic compensation p lot for CAL . partition in ATPS

图 1  双水相中 CAL 分配的熵 2 补偿图 焓

   1 表明 , 体系在 PEG1 000 —6 000 时得到了 图 负熵变值 ,为放热过程 , PEG10 000 时得到一个正熵 变值 ,为吸热过程 。负熵变表明当蛋白质从下相转 移到上相时 ,蛋白质 2 合物复杂物最终状态的有序 聚 作一定值 。温度变化影响上下二相物理性质的变 化 ,从而影响到了 CAL 的分配系数 ,但总的来说 ,温 度对分配系数的影响不是很大 (如图 2 ) 。在常温下 操作 , CAL 的活性收率依然较高 , 同时有利于相分 离和节约能源开支 , 故选择在室温下进行下面的实 验。
图 2  温度对 CAL 分配系数的影响
Fig 2  Effect of temperature on K ( CAL ) .

形成 。正熵变说明在 PEG10 000 与蛋白质之间有一 个排斥力 。此正热动力学值可以被解释为 : 由于蛋 白质域的位阻效应 , PEG和蛋白质域之间缺少相互 作用 。 由图 1 可知 ,温度变化不大时 ,ΔH 可以*似看

2. 2  PEG相对分子质量对 CAL 分配*衡影响

实 验 中 , PEG 的 质 量 分 数 均 为 17% , 而 (NH4 ) 2 SO4 的质量分数均为 10% ,将 CAL 在 pH 值

为 7. 5 磷酸盐缓冲液中的相对活力定义为 100% 。 在硫铵盐富集相中 ,由于硫铵盐对 CAL 的沉淀 作用 , CAL 活力得到了提高 。在上相中 , 对于 PEG1 000、 PEG2 000 和 PEG4 000 酶活力也有一个提高 , 但随着 PEG相对分子质量的增加 , CAL 的活力有所 下降 。这也证明了 PEG对酶具有修饰作用 (通过与 蛋白质的相互作用 ,修饰酶的活性位点 ,从而影响其 活性 ) 。 图 3 还表明了 PEG相对分子质量对于分配系 数的影响 。随着 PEG相对分子质量增大 , K ( CAL ) 值增大 , PEG6 000 和 PEG10 000 却相反 。这是由 于高质量分数的 PEG 溶液渗透到 CAL 的水化层 使 PEG分子 (具有部分疏水性 ) 与蛋白质的疏水 区进行相互作用的结果 。因此 , PEG 对蛋白质的 影响归于 2 个相对因子的*衡 : 一个是 PEG 的排

杨建军等   双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶

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斥力 ,另一个是 PEG2 白质通过蛋白质暴露在溶 蛋 剂中的疏水区黏合在一起 , 其主要依靠蛋白质的 化学结构 。具有大面积疏水区的蛋白质在溶剂中 与 PEG的相互作用应是驱使蛋白质在 PEG 富集 相中 分 离 的 唯 一 因 素 。也 有 研 究 者 证实了 PEG是一个柔性分子 , 它能够通过分子间的疏水 键获得一个紧密的稳定结构 , 此结构使其比完全 伸展时与溶剂的相互作用更小 , 但与蛋白质的相 互作用增强 。
图 3  PEG 相对分子质量对 CAL 分配系数及相对活力的影响
Fig 3  Effect of PEG relative molecular mass on K ( CAL) . and CAL relative activity

在增大 , PEG2 000 与 CAL 疏水区的相互作用逐渐增 强 。只有二相的质量分数均达到一定值时 , 才会很 容易地形成二相 ,并在上相中富集 。如果 PEG2 000 的质量分数不够大 , 增大硫铵的质量分数对于 CAL 在上相中的富集似乎没有太大的影响 , 这是由于 PEG与蛋白质的结合和硫铵对其的沉淀作用相比 没有占据优势地位 。当 PEG2 000 的质量分数达到 18%左右 , 硫铵的质量分数达到 11%时 , 双水相体 系 才 能 较 好 地 对 CAL 进 行 分 离 纯 化 , 此 时 K ( CAL ) = 7. 53。
2. 4  NaC l质量分数对 CAL 分配*衡影响

从图 3 中不难发现 , 无论从相对活力考虑还是 从分配系数来看 ,应该选择 PEG2 000 作为双水相体 系中的上相组成物质 。

2. 3  PEG /硫铵系统中硫铵质量分数对 CAL 分配

*衡影响 分别在 PEG质量分数为 14% , 16%和 18%时 , 研究硫铵质量分数对 K ( CAL )的影响情况 。结果如 图 4 所示 。

[ 52 ] 6

在质量分数 18% PEG2 000 和 12%硫铵组成的 ATPS中 ,研究了 NaC l质量分数对 K ( CAL ) 的影响 。 当 NaC l质量分数在 0 —3%时 , K ( CAL ) 在增加 ; 当 在 3% —5%时 , K ( CAL )却有所下降 。 根 据 A lbersson 方 程 : ln Kp = ln Kp + FZp / ( R T ) ,蛋白质的 分离 受到 Zp (蛋 白质 静电 荷 ) 和
Kp (在零界面势系统中或蛋白质等电点时的分配
0 0

系数 ) 2 个因素影响 。此双水相体系中引入 N aC l + 时 ,由于 N a 和 C l 在 A TPS二相中的分配系数不 同 ,从而影响到界面的电势能 , 进而影响到了分配 *衡 。只有设法改变界面电位 , 就能增强聚合物 与蛋白质之间的相互作用 , 就能控制蛋白质等荷 电大分子转入某一相 。如加入适量的 N aC l, 改变 界面电位 ,使带负电荷的蛋白质转入 PEG富集相 , 有助于分配系数的提高 。由图 5 可知 , N aC l的添 加质量分数应控制在 2% 。

图 5  NaC l质量分数对 CAL 分配系数的影响
Fig 5  Effect of NaCl mass fraction on K ( CAL) .

2. 5  PEG2 000 /硫铵系统优化

图 4  PEG2 000 /硫铵系统中 CAL 分配系数 与硫铵质量分数的关系

Fig 4  Relationship between K ( CAL ) and mass fraction of . ammonium sulfate in ATPS

上述实验中所用的 CAL 包含了其他未知蛋白 质 , PEG上相中富集 CAL 的同时也可能富集了大量 的杂蛋白 。故分配系数应结合酶回收率 y ( CAL ) ( % )来综合评价 ATPS的优劣 。 以 PEG2 000 /硫铵体系为分离体系 ,以脂肪酶回 收率为考察指标 ,考察了 PEG2 000 质量分数、 硫铵质

   随着 PEG2 000 质量分数的增加 , K ( CAL ) 一直

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化学工程  2009 年第 37 卷第 5 期

4 量分数、 NaCl质量分数三因素 , 选用 L9 ( 3 ) 正交表 。 因素水*取值见表 1,实验结果见表 2。

3  结论

表 1  萃取系统优化正交实验因素与水*
Table 1  Levels and factors of op ti izing extraction system m w ith orthogonal experim ent %

研究发现 ,温度对分配系数的影响不是很大 ,在 常温下操作 , CAL 的活性收率依然很高 ; 在低相对 分子质量时 , PEG与蛋白质的疏水作用可促进 CAL 的分配 ,并且二相间电势差等对分配*衡有较大影 响 ; 只有二相的质量分数均达到一定值时 ,才会很容 易地形成二相 ,并在上相中富集 。南极假丝酵母脂 肪酶分离的理想体系为 PEG2 000 /硫铵双水相体 系。 结果表明 , 南极假丝酵母脂肪酶在 PEG2 000 / 硫铵体系中的最佳分离条件为 : 在室温下 ,质量分数 20% PEG2 000, 12% ( NH4 ) 2 SO4 , 1. 5% NaC l。此时
K ( CAL ) = 8. 16, y ( CAL ) = 91. 2% 。

因素 水*
A PEG2 000 1 2 3 16 18 20 B (NH4 ) 2 SO4 11 12 13 C NaCl 1. 5 2. 0 2. 5

   从表 2 中可知 , 三因素的极差 R 大小依次为 : RA > RC > RB , 也就是 PEG2 000 的质量分数对体系 的分离情况影响最大 , 其次是 NaCl, 影响最小的为 ( NH4 ) 2 SO4 。各因 素水 *的 最佳 组合为 A3 B2 C1 : 20% PEG2 000, 1. 5% NaC l, 12% ( NH4 ) 2 SO4 。此条 件组合在正交实验中有 ,此时 y ( CAL ) = 91. 2% 。
表 2  萃取系统优化正交实验与结果
Table 2  Result of orthogonal experim ent for op tim izing extraction condition

参考文献 :
[ 1 ]  BRADFORD M M. A rap id and sensitive method for the quantitation of m icrogram quantities of p rotein utilizing the p rincip le of p rotein2dye binding[ J ]. Analytical B iochem is2 pancreatic lipase partition in aqueous two 2 phase system s 228. partitioning of p roteins in aqueous two phase system s[ J ]. 289 2 295. The Journal of Chem ical Thermodynam ics, 2005, 37 ( 3 ) : tw een p roteins and polyethylene glycol[ J ]. J B iol Chem , 1981, 256 ( 2 ) : 625 2 631. 2005, 17 ( 2 ) : 230 2 232. activity coefficient model based on group contribution for try, 1976, 72 (2) : 248 2 254. tion phenomena in water solutions of p roteins and s mall

[2]  谢涛 ,王雯娟 ,吴如春 ,等 . PEG / ( NH4 ) 2 SO4 双水相体

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[ 3 ]  BASSAN I G, FARRUGGI B , NERL I B , et al Porcine A .
y ( CAL ) / %

实验
A 1 2 3 4 5 6 7 8 9
K1 K2 K3 R

因素
B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 76. 233 80. 000 77. 967 3. 767 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 79. 800 79. 233 75. 167 4. 633 1 1 1 2 2 2 3 3 3 70. 600 77. 767 85. 833 15. 233

70. 1 72. 4 69. 3 78. 8 76. 4 78. 1 79. 8 91. 2 86. 5

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[ 4 ]  LUMRY R , RAJENDER S Enthalpy2entropy compensa2 . [ 5 ]  HAGHTALAB A , MOKHTARAN I B , The UN IFAC 2 NRF [ 6 ]  LEE J C, LEE L L. Preferential folvent interactions be2 molecules: a ubiquitous p roperty of water [ J ]. B iopoly2 mer, 1970, 9 (10) : 1125 2 1227.

[ J ]. Journal of Chromatography B , 2007, 859 ( 2 ) : 222 2


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